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Korean J Helicobacter  Up Gastrointest Res > Volume 22(4); 2022 > Article
에스트로겐 수용체α 양성 미만형 위암에서 에스트로겐과 헬리코박터 파일로리 CagA의 암 진행 기전
요약: 미만형 위암은 장형 위암과 마찬가지로 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 중요한 원인인자로 여겨지고, 장형 위암에 비해 젊은 여성에서 상대적으로 발생 비율이 높지만 아직까지 정확한 기전은 밝혀지지 않았다. 이 연구에서는 성호르몬인 에스트로겐(estrogen)과 헬리코박터 파일로리에 의한 미만형 위암 발생 및 진행 기전을 규명하고자 실험연구를 진행하였다. 미만형 위암세포주와 장형 위암세포주에서 에스트로겐 수용체α (estrogen receptor α, ERα)의 발현을 확인하였다. 에스트로겐 수용체α 양성 미만형 위암세포주에 에스트로겐을 처리한 경우, 에스트로겐 수용체α 음성 미만형 위암세포주와 달리 세포 생존능(cell viability)이 증가하였고 이동 능력(migration ability), 침입 능력(invasion ability), 상피간엽이행(epithelial-to-mesenchymal transformation, EMT) 마커(marker)들의 발현이 증가함을 확인하였다. 또한 회전 타원체 배양(spheroid culture)으로 줄기세포능(stemness)을 측정하였을 때, 에스트로겐을 처리한 미만형 위암세포주 중에서 에스트로겐 수용체α가 존재하는 경우 줄기세포능 마커들의 발현과 회전 타원체(spheroid) 사이즈 역시 증가함을 확인하였다. 에스트로겐 길항제인 풀베스트란트(Fulvestrant; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 처리하여 에스트로겐의 효과를 제거했을 때 대조군(vehicle)과 비슷한 결과가 나타나는 것으로 보아 앞서 확인한 변화는 에스트로겐에 의한 변화임을 확인하였다. 반면에 에스트로겐 수용체α의 유무와 상관없이 장형 위암의 경우 에스트로겐을 처리해도 변화가 없음을 확인하였다. 한편, 유방, 폐, 간과 같은 여러 고형 종양에서 종양 유전자(oncogene)로 알려진 long non-coding RNA인 HOTAIR의 프로모터에는 여러 에스트로겐 반응 요소(estrogen response element, ERE)가 포함되어 있는데, 에스트로겐 수용체α 양성 유방암세포의 경우 mixed-lineage leukemia protein 3 (MLL3)과 같은 여러 공동 조절인자(coregulator)들과 에스트로겐이 복합체를 이루어 HOTAIR의 발현을 유도한다고 알려져 있다.[1,2] 미만형 위암 역시 에스트로겐 수용체α 양성 미만형 위암세포주에 에스트로겐을 처리하면 HOTAIR의 발현이 2배 이상 증가하였고, 촉진자 분석(promoter assay)을 통해 분석한 결과 에스트로겐과 에스트로겐 수용체α가 다양한 공동 조절인자들과 함께 HOTAIR의 발현을 직접적으로 조절한다는 것을 확인하였다. 더욱이 헬리코박터 파일로리가 발현하는 독소단백 cytotoxin‑associated gene A (CagA)는 공동 조절인자 중 하나인 MLL3의 발현을 유도하기 때문에 결과적으로 CagA 역시 간접적으로 HOTAIR의 발현을 조절함을 확인하였다. 또한 과발현 벡터(over-expression vector)를 이용하여 에스트로겐 수용체α 양성 미만형 위암세포주에 HOTAIR의 발현을 유도하면 에스트로겐을 처리하지 않아도 상피간엽이행 마커들의 발현이 증가함을 보였고, siRNA를 이용하여 HOTAIR의 발현을 억제시키면 에스트로겐을 처리하더라도 상피간엽이행 마커들의 발현에 변화가 보이지 않았다. 결과적으로 에스트로겐 수용체α 양성 미만형 위암세포주에서는 에스트로겐에 의해 종양 유전자인 HOTAIR가 증가하고 이로 인해 다양한 종양형성(tumorigenesis)이 유도된다는 것을 확인하였다.
헬리코박터 파일로리는 장형 위암의 발암 기전에 관여할 뿐 아니라 미만형 위암과도 밀접한 관련이 있으나 명확히 밝혀진 바는 없다. 이 연구에서 헬리코박터 파일로리를 접종한 미만형 위암세포주 내에서 에스트로겐 수용체 복합체(ER complex)에 포함되는 단백질들의 발현을 확인하였고 그 결과 공동 조절인자인 MLL1과 MLL3의 발현이 높아짐을 확인하였다. 특히 MLL3의 경우, 헬리코박터 파일로리가 발현하는 독소 중 하나인 CagA가 존재하는 경우에만 발현이 높아지는 것으로 보아 CagA가 MLL3의 발현을 유도한다는 것을 알 수 있었다. 또한, 에스트로겐과 헬리코박터 파일로리를 함께 처리한 후 발생하는 시너지 효과를 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 헬리코박터 파일로리 유래 독소인 CagA를 분리하여 벡터로 과발현을 유도하였고 이후 에스트로겐을 처리하고 HOTAIR의 발현을 확인하였다. CagA만 과발현된 경우 HOTAIR의 발현에 큰 차이를 보이지 않았으나, 에스트로겐을 함께 처리한 경우 단독 처리에 비해 HOTAIR의 발현이 약 3.5배 증가하였다. 이는 에스트로겐을 단독 처리하였을 때 약 2배의 HOTAIR 발현 증가와 비교해도 높은 발현율이다. 또한 상피간엽이행 마커나 줄기세포능 마커 역시 헬리코박터 파일로리와 에스트로겐을 병용 처리한 경우 에스트로겐 단독 처리에 비해 더 증가함을 확인하였다. 결과적으로 에스트로겐과 헬리코박터 파일로리의 독소인 CagA가 함께 존재하는 경우 단독에 비해 미만형 위암세포주에서 상피간엽이행, 줄기세포능이 증가하였다.
다음으로 오가노이드(organoid)를 이용한 생체 밖 연구(ex vivo study)를 진행하였다. 미만형 위암 환자로부터 얻은 위암 조직에서 위암 오가노이드를 배양하였고, 미만형 위암 오가노이드 중 3명의 환자로부터 분리한 에스트로겐 수용체α 양성 위암 오가노이드는 2명의 환자로부터 분리한 에스트로겐 수용체α 음성 미만형 위암 오가노이드와 달리 에스트로겐을 처리했을 때 위암 오가노이드의 크기가 크게 증가하였고, 동시에 HOTAIR의 발현도 높게 나타났다. 또한 이동 능력 검사를 진행한 결과, 에스트로겐 수용체α를 발현하는 위암 오가노이드는 에스트로겐 처리 후 이동 능력이 증가함을 확인하였다.
마지막으로 진행 위암 환자 180명의 정상 조직과 위암 조직에서 에스트로겐 수용체α와 HOTAIR 발현의 상관관계를 확인한 결과, 장형 위암 환자의 위암 조직보다 미만형 위암 환자의 조직에서 에스트로겐 수용체α와 HOTAIR의 발현이 모두 높았으며, 두 유전자 간의 상관관계가 상당히 높음을 확인하였다. 또한 헬리코박터 파일로리에 감염된 환자들 중 에스트로겐 수용체α 발현 유무로 나누어 HOTAIR의 발현을 확인한 결과, 에스트로겐 수용체α를 발현하는 환자들 중 헬리코박터 파일로리에 감염된 경우 HOTAIR의 발현이 그렇지 않은 환자군에 비해 높아짐을 확인하였다.
해설: 위암은 최근 빈도가 줄어가는 추세이나 남자에서 2위, 여자에서는 4위로 여전히 우리나라 전체 암 발생 건수의 11.6%를 차지하는 가장 흔한 암 중 하나로 알려져 있다[3]. 그중 미만형 위암의 경우, 우리나라에서 발생하는 위암의 약 1/3에 해당하는데 근래에 전 세계적인 위암 감소는 장형 위암에 국한되며 오히려 미만형 위암의 발생 비율은 증가되는 추세이다[4,5]. 특히 미만형 위암은 젊은 연령에서 여성 환자의 비율이 높고, 젊은 여성일수록 사망률이 높다[6,7]. 원인으로는 에스트로겐 등 여성 호르몬과 연관 있을 것으로 추측되지만 아직 연구는 이루어지지 않았다. 또한 헬리코박터 파일로리에 의한 젊은 결절성 위염 환자에서 미만형 위암으로 발전된다는 보고들이 있고, 헬리코박터 파일로리에 대한 혈청 항체가 있을 때 미만형 위암의 위험도가 약 3배 가량 증가하는 것으로 보아[8] 헬리코박터 파일로리가 장형 위암뿐만 아니라 미만형 위암의 원인인자일 가능성이 높지만 발암 과정은 거의 밝혀진 바가 없다.
이전 연구를 통해 호르몬 의존도가 높은 장기의 종양에서 호르몬 수용체의 존재가 호르몬 요법을 시행할 때 유리한 예후를 보인다고 알려져 있으나, 위를 포함한 호르몬 비표적 장기의 종양에서는 호르몬 수용체의 역할이 크게 알려진 바가 없다[9-11]. 본 연구 결과는 에스트로겐 수용체α가 존재하는 경우, 에스트로겐에 의해 발암 유전자인 HOTAIR의 발현이 증가하고 이로 인해 미만형 위암이 진행된다는 것을 확인하였다. 또한 헬리코박터 파일로리가 발현하는 독소단백 CagA가 에스트로겐 수용체 복합체의 공동 조절인자 중 하나인 MLL3를 유도하는 것을 보아, 두 물질을 함께 미만형 위암세포주에 처리했을 때 HOTAIR의 발현이 더욱 강하게 유도되고, 그로 인한 상피간엽이행, 줄기세포능이 증가하는 것을 시사하였다. 즉, 헬리코박터 파일로리와 호르몬이 동시에 작용하여 미만형 위암 진행을 촉진시키는 기전을 규명하였고, 호르몬 레벨이 생리적으로 증가된 폐경 전 여성에서의 미만형 위암 발생 비율이 높은 것과 전체 위암의 남녀 비율이 3:1인 것과 대조적으로 40세 미만 환자에서 위암의 남녀 비율이 1:1임을 설명할 수 있는 하나의 근거로 작용할 수 있을 것이다.
흥미로운 것은 이 연구에서 에스트로겐의 세포 처리 농도가 0.1 nM였는데, 이는 폐경 전 여성의 생리적 혈청 농도인 0.1~2.3 nM에 속한다[12]. 여성이 임신하였을 때 정상적으로 고농도의 혈청 에스트로겐 농도(최대 73.420 nM)가 유지되는 것은 임신 시 미만형 위암의 빠른 진행을 설명할 수 있을 것으로 생각되며[13], 이 연구에서 출산 직후 진단된 위암 환자의 조직에서 고농도의 에스트로겐 수용체α 발현과 HOTAIR 발현을 보여주었으나, 샘플 사이즈가 적어 유의한 차이는 보여주지 못했다. 임신 시 빠른 암 진행에 대해서도 더 많은 연구가 필요하겠다.
또한 이 연구에서는 장형 위암의 환자의 정상 조직에 비해 위암 조직에서 에스트로겐 수용체α의 발현은 높았다. 그러나 에스트로겐 수용체α 양성 장형 위암세포주에 에스트로겐을 처리해도 상피간엽이행, 줄기세포능이 증가하지 않았고, 에스트로겐 수용체α 양성 장형 위암 오가노이드에 에스트로겐을 처리하였을 때, 오가노이드 성장에 영향이 없었던 것을 볼 때, 에스트로겐 및 에스트로겐 수용체α가 미만형 위암과 장형 위암에서 다른 역할을 수행하며, 장형 위암의 경우 미만형 위암과 달리 에스트로겐-에스트로겐 수용체α 경로를 거치지 않는 것으로 보인다. 향후 이와 관련된 더 많은 연구가 필요하겠다.

Acknowledgements

Funding: This study was supported by a grant from the National Research Foundation of Korea (#NRF-2022R 1A2B5B01001430) and the Korean College of Helicobacter and Upper Gastrointestinal Research Foundation (KCHUGR – 202002001).

CONFLICTS OF INTEREST

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

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